シークエンシングされたリードは、トランスクリプトの一部となっている。これらのリードの塩基配列とゲノム（リファレンス）配列を比べることで、各々のリードがゲノム上のどの遺伝子領域に由来するのかを明らかにすることができる。このように、リードとゲノム配列を比較して、リードの由来箇所を決めることをマッピングあるいはアラインメントとよぶ。

マッピング用のプログラムとして、STAR、HISAT2、BWA などが有名である。これらのプログラムは、FM index とよばれる文字列検索アルゴリズムを使用してマッピングを行なっている。したがって、これらのプログラムを使用するには、まずゲノム配列を FM index で検索できるように Burrows-Wheeler 変換しておく必要がある。この作業をインデックスの作成などという。インデックスを作成してから、FM index でリードと完全一致するゲノム配列上の位置を検索する。FM index では完全一致による検索アルゴリズムであるため、ギャップやミスマッチを許容できない。そこで、これらのプログラムは、まずリードの一部分だけをゲノム配列に対して完全一致で検索し、ヒット箇所があればその近くで Smith-Waterman アルゴリズムでアラインメントを伸ばすこととしている。

マッピングの際に使用するリファレンス配列は、モデル生物であれば、データベースで公開されていることが多い。有名なデータベースとして、RefSeq、UCSC や Ensembl などのデータベースがある。RefSeq ゲノムは NCBI から公開され、様々な研究に広く使われている。また、UCSC ゲノムは UniProt や GenBank mRNA などからデータを集めてアノテーションをつけている。Ensembl ゲノムは UCSC や Vega などデータを集めて自動アノテーションプログラムによってアノテーションを付けを行っている。アノテーション数としては Ensembl ゲノムが一番多い。三者において共通のアノテーションを持つ遺伝子が多く含まれているが、一方にあり他方にないような遺伝子も数多く含まれている。このようなアノテーションの違いが、トランスクリプトームの発現量を取得する際に大きく影響を与えてしまう（Zhao et al, 2015）。マッピング率として、アノテーション数の一番多い Ensembl の方が大きい。ただし、注意したいのはどのアノテーションを使おうと、不完全なアノテーションや完全に間違っているアノテーションが含まれていることを念頭におく必要がある。非モデル生物のシークエンサーデータを解析する場合は、リファレンス配列を作ることから始める必要がある。シークエンサーデータ、すなわちリードの配列を利用して、元の転写領域の配列を復元することをアセンブリという。非モデル生物を対象する場合に、アセンブリを行なってからマッピングを行うが一般的である。

シークエンサーのデータ量が増えるにしたがって、マッピングに要する時間も長くなりつつある。そこで、マッピングを行うのではなく、リファレンス配列をハッシュ化して、リードの配列をハッシュのキーとして、そのキーがどの転写産物の配列から作られたハッシュに存在するのかを調べることで、擬似的にそのリードの由来元を推定する プログラムが開発されている。kallisto や salmon などがハッシュを利用した擬似アラインメントプログラムである。この種のプログラムは、速度が速いものの、ミスマッチや indel に対して弱いことが知られている。解析対象の生物種のゲノムの質とそのアノテーションの質に応じて使うかどうかを決めると良い。